CRISPR技术构建植物突变体库

CRISPR技术构建植物突变体库

全基因组范围的植物突变体是进行该植物物种（品种）功能基因组学基础理论研究，分子品种设计育种和筛选优良性状的重要材料。传统T载体随机插入构建植物突变体库在拟南芥得到了广泛应用，但是该方法是工作量巨大，致命缺陷是无法获得全基因组基因突变库。而被喻为“遗传手术刀”的CRISPR/Cas9基因组编辑技术能对特定目标靶基因进行精准的编辑，通常只在靶位点造成几个碱基的替换、插入或者删除，这与基因组上时常发生的自然变异或诱导突变本质相同，在农作物分子遗传改良育种上具有广阔的应用前景。

利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术和高通量的寡核苷酸芯片合成技术，大规模构建植物突变体库并进行高通量功能筛选是高效便捷获得该物种重要突变体和快速克隆对应基因的有效方法，同时能够为该物种遗传改良和分子设计育种提供重要的供体材料，为大规模的植物功能基因组学基础理论研究和品种设计育种提供了一个非常有意义的研究平台。

CRISPS/gRNA技术构建植物突变体库的过程

实验步骤和内容

步骤	说明
gRNA靶点的设计	设计gRNA靶点，每个基因3-6个靶点
CRISPR/Cas9-lib载体构建（可选）	根据CRISPR/Cas9-gRNA表达Ti载体，改造成用于建库的Ti 载体CRISPR/Cas9-lib。
高通量Oligo pool 合成	高通量合成gRNA靶点的oligo pool，每片最多合成12K条oligo
gRNA质粒文库的构建	将gRNA靶点构建到CRISPR/Cas9-lib表达载体中，构建gRNA Ti载体质粒文库。由于国内感受态效率原因，以12K gRNA靶点为单元，做分文库
挑单克隆测序检测文库质量	按照库gRNA靶点数目10%，挑单克隆测序。对于12k靶点的分库，测序120个克隆
高通量测序检测文库质量	检验构建的gRNA Ti载体质粒文库的质量
gRNA农杆菌文库构建（可选）	将gRNA Ti载体质粒文库转化到农杆菌中。

突变库构建的前提

1）能在目标植物物种工作的CRISPR/Cas9体系

2）目标植物物种（品种）基因组数据

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