cicRNA测序

样本类型

样本要求

保存及运输条件

说明内容

新鲜组织

新鲜组织标本（肿瘤样本在术后30分钟内取得）≥50 mg（黄豆粒大小）可采用以下方法：

1.RNAlater：尤其适用于肿瘤组织，离体后于冰上快速切成小块，组织块直径最好介于1-5 mm（小米至绿豆大小），浸泡在5倍体积的RNAlater中，充分浸润（最好4℃过夜，以保证浸润效果），-80℃保存；如果是肿瘤样本，应尽可能准确地判定肿瘤组织和正常组织。

2.TRIzol：在冰上快速分成小块，组织块直径最好不大于5 mm（绿豆大小）浸泡于TRIzol中，冻存管或者离心管封口膜封好后送样。

3.液氮：离体后液氮速冻充分，预冷冻存管，将组织转移至冻存管中，液氮可长期保存。

干冰运输

建议样本备份1-2份，收样后立即提取。

细胞

提取mRNA需细胞数量＞5×10⁶个，lncRNA需＞1×10⁷个。

1.悬浮细胞收集用PBS缓冲液快速洗一次，每5×10⁶个细胞加入1 mL TRIzol，用移液器吹散，溶液呈清亮不粘稠状；-80℃保存不超过1个月；

2.贴壁细胞需将培养基尽量吸弃；按每10 cm²培养面积（相当于六孔板一个孔或35 mm直径培养皿）加1 mL TRIzol；移液器反复吹打，使TRIzol完全接触长有细胞的培养瓶表面，充分消化；转移到RNase-free的离心管中，用一次性注射器反复吹打细胞直至看不见成团的细胞块，整个溶液呈清亮不粘稠状，-80℃保存

干冰运输

建议样本备份1-2份，收样后立即提取。

外周血（RNA）

1.TRIzol：15 mL管中加入6 mL TRIzol和2 mL新鲜血液（TRIzol：血液=3：1），移液器吹打以帮助裂解样品中的细胞；样品剧烈震荡混匀1-2 min，直到絮状物全部溶解；室温孵育5 min使核蛋白体完全分解；封口膜封存，-80℃冻存。注意：冰冻血液溶解过程中会有破碎的细胞释放RNA酶，因此建议在冰冻前加入TRIzol，切勿直接冻存新鲜血液，保存好的血液应避免反复冻融。离心得到白细胞或有核细胞，可加TRIzol，-80℃保存，干冰运输。

2.BD PAXgene Blood RNA Tube：人类血液样本推荐使用，采集量为2mL左右，18-25℃可保存3天，2-8℃可保存5天，-20℃或-70℃至少可稳定50个月。

3.使用RNAlock血液RNA稳定剂保存，新鲜抗凝血液：血液RNA稳定剂=1：3，盖上管盖，上下颠倒混匀8-10次。室温放置2h以上后低温保存；含有血液RNA稳定剂的人血液样品可在2-8℃保存5天，或在-20℃条件下至少保存三个月；含有血液RNA稳定剂的哺乳动物血液样品可在15-25℃保存2天，2-8℃保存7天，或在-20℃条件下至少保存六个月。

TRIzol保存法需干冰运输；BD PAXgene Blood RNA Tube 保存法可使用足量冰袋，用泡沫箱运输

Total

RNA

总RNA溶解于DEPC水或者RNase-free的缓冲液中。总量≥2 μg；纯度OD_260/280≥2.0；完整性RIN≥8.0；浓度≥100 ng/μL。

使用1.5 mL或2 mL离心管盛放，用parafilm封口膜密封，然后将样本管置于保护用的50 mL离心管或其他类似容器里，并旋紧盖子。使用足量冰袋，用泡沫箱运输。