基于siRNA/miRNA的高通量筛选

我们的策略是直接在功能上研究，通过siRNA沉默候选基因筛选得到功能基因。siRNA和药物联合使用可以筛选到能够起增敏作用的靶基因。这些数据为靶向治疗和联合用药提供了重要依据。基于全基因组siRNA文库的高通量筛选，可平行分析成千上万条基因功能，大大加快研究进程，从而能迅速、全面地鉴定出细胞过程或信号传导途径的相关基因，以及疾病相关的药物靶基因，保证研究成果更为系统和新颖。

技术介绍

基于多孔板和液体工作站的筛选方法

预先将siRNA文库里各条siRNA分别与转染试剂混合，转移到384或96微孔板中，然后将培养好的细胞接种到微孔板里，细胞被转染siRNA。经过48-72小时的培养，蛋白表达水平被沉默后，通过高通量的微孔板读数仪或高内涵扫描显微镜读出孔板里的细胞信号。若这些细胞信号与参照组相比发生了显著变化，则认为相应的siRNA与研究的细胞过程相关，从而鉴定出相关的候选基因

自组装细胞芯片筛选技术

除了传统的孔板筛选服务外，筛选平台针对大规模筛选需求，成功开发出先进的自组装细胞芯片技术（Self-assembled Cell Microarray，SAM cell）。在玻璃盖玻片上，利用微加工技术（micro-fabrication）使细胞自组装形成细胞小岛微阵列，高集成化的微阵列极大地提高了筛选通量。同时采用反向转染技术，简化了转染过程，延长了保存时间，这将大大减少筛选中使用的siRNA和相应的转染试剂。SAM cell技术已经大量应用于siRNA文库、质粒文库及化合物文库的高通量筛选。

SAM cell技术流程

在芯片上点印siRNA、质粒或者化合物，接种细胞后，细胞在自组装形成细胞岛点阵，同时相应位置上点印的内容自动转染到对应的细胞小岛，最后通过高内涵图像扫描系统成像，分析实验结果。

细胞岛间无交叉污染

在25x25mm的盖玻片上，细胞在自组装形成点阵的同时转染表达GFP的质粒，细胞小岛间隔形成荧光点阵，而相邻的细胞小岛（没有转染GFP质粒）则没有荧光信号。

成功案例

1、已知药物功能筛选其增敏靶点

筛选策略：

1.   明确该药物功能，明确该药物药效的dose curve。

2.   选取与此项功能相关的信号通路，设计合成siRNA，建立文库。每个基因设计合成3条siRNA。如涉及面广，可直接使用全基因组siRNA文库。如果小规模试筛，可以考虑选取激酶siRNA文库，700个基因。

3.   开展筛选工作：低剂量的药物与siRNA文库共筛，以高剂量药物作用组为正对照，鉴定出增敏效果的siRNA。

4.   根据增敏结果，结合生物信息学分析，推断出药物增敏靶点以及药物作用的信号通路，甚至是药物直接作用的靶基因。

2、已知功能基因筛选调控该基因的miRNA

筛选策略：

1.   人类miRNA mimics文库构建：约1100条，或由客户定制。

2.   荧光素酶报告基因载体构建：根据目的基因3’UTR的长度而定，一般每300-800bp构建一个载体。

3.   筛选：建议使用Hela细胞系，或目标细胞系，96孔板筛选。

每个报告基因载体都要将miRNA文库筛选一遍。

每孔共转染报告基因质粒，miRNA mimics，内参renilla质粒。以不干扰任何基因的siRNA NC 为阴性参照。

48小时后裂解细胞，使用酶标仪测量luciferase活性。活性降低的为阳性miRNA。

现货孔板文库信息

成品文库信息：

1.  人类全基因组siRNA文库：约21000 个基因，每个基因对应3条siRNA，分别为A，B，C三个亚库。

siRNA序列设计参考美国著名siRNA生产商，3'末端采用特殊修饰。

分装在384孔板中，规格为每孔5-8pmol，氩气保护，铝膜封装，-80度储存。

报价：总价25W，单买一个亚库10W。

货期：1周。

2.   人类激酶siRNA文库：约700个基因，每个基因对应3条siRNA，分别为A，B，C三个亚库。

siRNA序列设计参考美国著名siRNA生产商，3'末端采用特殊修饰。

分装在96孔板中，规格为每孔20-25pmol，氩气保护，铝膜封装，-80度储存。

报价：总价8W，单买一个亚库3W。

货期：2-3周。

3.   人类磷酸化酶基因siRNA文库：约300 个基因，每个基因对应3条siRNA，分别为A，B，C三个亚库。

siRNA序列设计参考美国著名siRNA生产商，3'末端采用特殊修饰。

分装在96孔板中，规格为每孔20-25pmol，氩气保护，铝膜封装，-80度储存。

报价：总价4W，单买一个亚库1.5W。

货期：1-2周。

4.   人类miRNA模拟体文库：约1100 个miRNA

序列参考miRbase, 3'末端采用特殊修饰。

分装在96孔板中，规格为每孔20-25pmol，氩气保护，铝膜封装，-80度储存。

报价：6W。

货期：2-3周。

5.   FDA认证化合物文库：约1000个化合物。

DMSO溶解，分装在96孔板中， -80度储存。

询价。

参考文献：

1.  Whitehurst A W ,Bodemann B O , CardenasJ , et al. Synthetic lethal screen identification of chemosensitizer loci incancer cells[J]. NATURE, 2007, 446(7137):815-819.

2.  Junyu Yang, Milton E. Brown, HanshuoZhang, et al. High-throughput screening identifies microRNAs that target Nox2and improve function after acute myocardial infarction[J].Am J Physiol HeartCirc Physiol, 2017,312: H1002–H1012.