基于CRISPR/Cas9的高通量筛选

我们的策略是直接在功能上研究，通过gRNA敲除候选基因筛选得到功能基因。合成致死的靶基因，gRNA和药物联合使用可以筛选到能够起耐药作用的靶基因。这些数据为靶向治疗和联合用药提供了重要依据。基于gRNA文库的高通量筛选，可平行分析成千上万条基因功能，大大加快研究进程，从而能迅速、详尽地鉴定出细胞过程或信号传导途径的相关基因，以及疾病相关的药物靶基因，保证研究成果更为系统和新颖。

基于慢病毒策略的单细胞筛选技术

1.  oligo用芯片方式合成，成本远低于传统化学方式。

2.  gRNA片段构建到慢病毒载体上，包装成慢病毒混合文库。

3.  通过控制病毒用量，尽量让每个细胞被一个基因的一个靶点所作用。

4.  利用控制细胞存活，结合免疫染色、流式细胞术等手段得到筛选后的细胞。

5.  筛选得到的细胞使用通用引物PCR，二代测序分析，通过比对得到gRNA信息，从而推断出起作用的靶基因。

成功案例

 已知药物功能筛选其耐药靶点

筛选策略：

1.   明确该药物功能，明确该药物的致死工作浓度。

2.  构建Cas9-gRNA慢病毒文库。侵染细胞，构建整合Cas9-gRNA的细胞混合克隆。

3.  开展筛选工作：高浓度药物短期内持续作用细胞混合克隆，成活的细胞即为产生耐药性的细胞，而产生耐药性的原因是Cas9-gRNA导致的基因变异。

4.  存活的细胞通过二代测序，比对得到gRNA信息，从而推断出起作用的基因靶点

成品文库信息：

1.  人源CRISPR/Cas9-sgRNA慢病毒文库：约21000个基因，每个基因对应6条gRNA。

慢病毒毒液，-80度储存。

询价。

参考文献：

1.  ShalemO , Sanjana N E , Hartenian E , et al.Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells[J]. Science, 2014,343(6166):84-87.