定点敲入小(大)鼠

技术原理简介

基因敲入(Knockin)鼠是指通过TALEN/CRISPR技术在目的序列位置引进特定的突变或外源基因的小鼠。通过针对基因靶序列设计相应的打靶质粒，然后根据需要插入的位置构建含Knockin片段或点突变的Donor质粒，将Donor质粒与打靶质粒共同显微注射进小鼠的受精卵中，TALEN/CRISPR定位到基因组上的靶序列并切割双链DNA，在随后的修复过程中，细胞以含同源序列的Donor质粒为模版修复基因组DNA，最终获得在目的DNA序列插入Knockin片段的Knockin小鼠。比如将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)通过同源重组的方式引入目的基因的特定位点，从而跟踪目标基因的表达；也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因，即：KO/KI同时发生。

TALEN/CRISPR构建定点敲入小(大)鼠技术流程图

服务流程及周期

服务流程及周期图

步骤	内容	周期
敲入元件获得	客户提供或全基因合成	根据实际情况而定
Cas9/gRNA的合成和同源模板(Donor)构建	合成Cas9/gRNA，检测Cas9/gRNA活性，构建同源模板质粒	2个月
得到Founder	Cas9/gRNA体外转录成mRNA和Donor质粒共同显微注射受精卵，胚胎移植到代孕母鼠子宫，3周后出生，2周龄基因型鉴定。	2-3个月
得到F1代杂合子	2个月后性成熟，Founder和野生型小鼠交配，3周后出生，2周龄基因型鉴定，获得稳定传代的基因突变杂合子F1代。	3-4个月