载体构建服务

TALE技术(Transcriptionactivator-like effectors)是一种分子生物学工具。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白。TALEN(Transcription activator-like effector(TAL)nucleases)技术是基于TALE与人工改造的核酸内切酶的切割域(FokI)构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶。通过TAL的DNA识别域结合到靶位点上，及FokI切割域形成二聚体后，可特异性对目标DNA序列实现切断。在随后的非同源末端连接修复过程中，断开的DNA双链会由于碱基的随机增减从而以一定的概率实现目标基因功能的缺失。

 

 

将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联，可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALEN。而且FokI需形成二聚体方能发挥活性，大大减少了随意剪切的几率。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22碱基）的靶序列（一般16-20个碱基）分别进行TALE识别模块构建。将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。

 

 

将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA，形成DSB（Double-Strand Breaks）,诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过NHEJ（Non-homologous End Joining）修复DNA，在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。

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CRISPR/Cas9载体构建

Clusteredregularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9是细菌和古细菌的一种不断进化适应的免疫防御机制。CRISPR的DNA识别区域是crRNA或向导RNA，Cas9蛋白负责DNA的剪切。当DNA结合域识别靶点DNA序列后，核酸内切酶或Cas9蛋白将DNA剪切，靶DNA双链断裂，再启动DNA损伤修复机制，实现基因敲除、插入等。

 

 

（来自Nature Biotech. 2012:30, 836–838）

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